Chuyển Hóa Acid Béo, Triacylglycerol Và Thể Ketone (Phần 2)

IV. Sự huy động chất béo và sự oxy hóa acid béo

Các acid béo tích trữ trong mô mỡ trắng, ở dạng TAG trung tính, đóng vai trò như là sự tích trữ năng lượng chính của cơ thể. TAGs cung cấp các sự tích trữ nồng độ cao của năng lượng chuyển hóa bởi vì chúng bị khử mạnh và hầu như là ở dạng khan. Năng lượng thu được từ sự oxy hóa hoàn toàn các acid béo thành CO₂ và H₂O là 9 kcal/grams chất béo (so với 4 kcal/grams protein hay carbohydrate).

A. Sự giải phóng acid béo từ chất béo

Sự huy động chất béo tích trữ cần sự giải phóng thủy phân của FFA và glycerol từ dạng TAG của chúng. Quá trình phân giải lipid này đạt được bởi các perilipins và lipases. Nó được khởi động bởi triglyceride lipase mô mỡ (adipose triglyceride lipase – ATGL), tạo ra một diacylglycerol mà là cơ chất phù hợp đối với lipase nhạy cảm hormone (hormone-sensitive lipase – HSL). Sản phẩm monoacylglycerol (MAG) của HSL được tác động bởi MAG lipase.

1. Sự điều hòa của perilipins và HSL: Cả perilipins và HSL được phosphoryl hóa bởi PKA, một protein kinase phụ thuộc cAMP (cAMP-dependent protein kinase). cAMP được sản xuất trong tế bào mỡ khi các catecholamines (như epinephrine) liên kết với các thụ cảm thể beta-adrenergic màng tế bào và hoạt hóa adenylyl cyclase (Hình 15). Quá trình thì tương tự với của sự hoạt hóa glycogen phosphorylase (xem Hình 9 bài viết trước). Sự phosphoryl hóa của perilipin bởi PKA cho phép sự dịch chuyển vị trí và sự liên kết của HSL phosphoryl hóa (HSL hoạt hóa) với các giọt mỡ. (Chú ý: Bởi vì ACC bị ức chế bởi sự phosphoryl hóa điều khiển bởi hormone khi mô hình qua trung gian cAMP được hoạt hóa [xem Hình 8 phần 1] nên sự tổng hợp acid béo được ngừng lại và sự thoái hóa TAG được thực hiện). Trong sự có mặt của các mức insulin huyết tương cao, HSL được dephosphoryl hóa và bất hoạt. Insulin cũng ngăn chặn sự biểu hiện của ATGL.

oxy-hoa-acid-beo-1 — **Hình 15** – Sự điều hòa hormone của sự thoái hóa diacylglycerol trong tế bào mỡ. (Chú ý: Triacylglycerol bị thoái hóa thành diacylglycerol bởi triglyceride lipase mô mỡ). cAMP = adenosine monophosphate vòng (cyclic adenosine monophosphate); PP_i = pyrophosphate; ADP = adenosine diphosphate; P = phosphate.

2. Số phận của glycerol: Glycerol được giải phóng trong suốt quá trình thoái hóa TAG không thể được chuyển hóa bởi các tế bào mỡ bởi vì chúng thiếu glycerol kinase. Thay vào đó, glycerol được vận chuyển qua máu đến gan, là nơi có kinase. Sản phẩm glycerol 3-phosphate có thể được sử dụng để hình thành nên TAG trong gan hoặc có thể được chuyển thành DHAP bởi sự đảo ngược của phản ứng glycerol 3-phosphate dehydrogenase được minh họa trong Hình 13 của phần 1. DHAP có thể tham gia vào trong quá trình đường phân và tân tạo đường.

3. Số phận của các acid béo: FFA có thể di chuyển qua màng tế bào của tế bào mỡ và liên kết với albumin huyết thanh trong máu. Chúng được vận chuyển đến các mô như cơ, đi vào trong các tế bào, được hoạt hóa thành các dẫn xuất CoA của chúng và được oxy hóa để sinh năng lượng trong ty thể. Bất kể các mức của chúng, FFA huyết tương không thể được sử dụng để sinh năng lượng bởi các tế bào hồng cầu (red blood cells – RBCs), tế bào mà không có ty thể. Não không sử dụng các acids béo để sinh năng lượng ở mức độ đáng kể, nhưng nguyên nhân thì chưa rõ ràng. (Chú ý: Hơn 50% acid béo được giải phóng từ TAG mô mỡ thì được tái ester hóa với glycerol 3-phosphate. WAT thì không có glycerol kinase và glycerol 3-phosphate thì được sản xuất bởi quá trình tân tạo glycerol, một phiên bản không hoàn chỉnh của quá trình tân tạo đường: pyruvate thành OAA thông qua pyruvate carboxylase và OAA thành phosphoenolpyruvate [PEP] thông qua phosphoenolpyruvate carboxykinase. PEP được chuyển [bởi các phản ứng chung với quá trình đường phân và quá trình tân tạo đường] thành DHAP, chất mà sẽ được khử thành glycerol 3-phosphate. Quá trình làm giảm FFA huyết tương, các phân tử liên quan với tình trạng kháng insulin trong đái tháo đường type 2 và béo phì [xem các bài viết tiếp theo]).

B. Sự oxy hóa β acid béo

Con đường chính cho sự dị hóa các acid béo là một con đường của ty thể được gọi là sự oxy hóa β (β-oxidation), trong đó các mảnh 2-carbon được loại bỏ một cách lần lượt từ đầu carboxyl của acyl CoA béo, tạo thành acetyl CoA, NADH và FADH₂.

1. Sự vận chuyển acid béo chuỗi dài vào trong bào tương và ty thể: Sự hấp thu của các acid béo có thể xảy ra nhờ sử dụng các cơ chế khác nhau. Nó có thể liên quan với sự khuếch tán thụ động hoặc một trong số một vài proteins vận chuyển lipid như acid béo translocase (fatty acid translocase – FAT), protein liên kết acid béo (fatty acid–binding protein – FABP) và protein vận chuyển acid béo (fatty acid transport protein – FATP). Các acid béo chuỗi dài (long chain fatty acids – LCFA) được hấp thu bởi FATP. Sau khi một LCFA đi vào trong một tế bào, nó được chuyển đổi trong bào tương thành dẫn xuất CoA của nó bởi acyl CoA béo chuỗi dài synthetase (thiokinase) (long-chain fatty acyl CoA synthetase [thiokinase]), một enzyme của màng ngoài ty thể. Bởi vì sự oxy hóa β xảy ra trong chất nền ty thể nên acid béo phải được vận chuyển qua màng trong ty thể mà không thấm với CoA. Vì thế, một chất mang chuyên biệt vận chuyển nhóm acyl chuỗi dài từ bào tương vào trong chất nền ty thể. Chất mang này là carnitine và quá trình vận chuyển giới hạn tốc độ này được gọi là “carnitine shuttle” (tạm dịch là sự vận chuyển qua lại của carnitine bởi vì carnitine qua lại màng trong ty thể) (Hình 16).

oxy-hoa-acid-beo-2 — **Hình 16** – Sự vận chuyển của carnitine (carnitine shuttle). Tác động toàn phần là một acyl coenzyme A (CoA) béo chuỗi dài (long-chain – LC) được vận chuyển từ bên ngoài vào bên trong ty thể. AMP = adenosine monophosphate; PP_i = pyrophosphate.

a. Các bước chuyển vị trí: Đầu tiên, nhóm acyl được chuyển từ CoA đến carnitine bởi carnitine palmitoyltransferase I (CPT-I), một enzyme của màng ngoài ty thể. (Chú ý: CPT-I còn được gọi là CAT-I [carnitine acyltransferase I]). Phản ứng này hình thành nên acylcarnitine và tái tạo CoA tự do. Thứ hai, acylcarnitine được vận chuyển vào trong chất nền ty thể trong sự trao đổi với carnitine tự do bởi carnitine-acylcarnitine translocase. Carnitine palmitoyltransferase 2 (CPT-II hay CAT-II), một enzyme của màng trong ty thể, xúc tác cho sự chuyển của nhóm acyl từ carnitine đến CoA trong chất nền ty thể, vì thế, tại tạo nên carnitine tự do.

b. Chất ức chế sự vận chuyển của carnitine: Malonyl CoA ức chế CPT-I, vì thế, ngăn cản sự đi vào của các nhóm acyl chuỗi dài vào trong chất nền ty thể. Vì thế, khi sự tổng hợp acid béo đang xảy ra trong bào tương (như được thực hiện bởi sự có mặt của malonyl CoA), palmitate hình thành mới không thể được chuyển vào trong ty thể và thoái hóa. (Chú ý: Mô cơ, mặc dù nó không tổng hợp các acid béo nhưng nó chứa isozyme ACC của ty thể [ACC2], cho phép điều hòa sự oxy hóa β. Gan chứa cả hai isozyme). Sự oxy hóa acid béo thì cũng được điều hòa bởi tỷ số acetyl CoA/CoA: Khi tỷ số tăng lên, phản ứng thiolase cần CoA sẽ giảm (Hình 17).

oxy-hoa-acid-beo-3 — **Hình 17** – Các enzymes liên quan trong sự oxy hóa β của acyl coenzyme A (CoA) béo. (Chú ý: 2,3-enoyl CoA hydratase cần một liên kết đôi trans giữa carbon 2 và carbon 3). FAD(H₂) = flavin adenine dinucleotide; NAD(H) = nicotinamide adenine dinucleotide.

c. Các nguồn carnitine: Carnitine có thể thu được từ chế độ ăn, khi mà nó được tìm thấy chủ yếu trong các sản phẩm từ thịt. Nó cũng có thể được tổng hợp từ các amino acids lysine và methionine bởi một con đường enzyme được tìm thấy trong gan và các thận nhưng không tìm thấy trong cơ xương hay cơ tim. Vì thế, các mô sau này thì sẽ hoàn toàn phụ thuộc vào carnitine được cung cấp bởi sự tổng hợp nội sinh hoặc chế độ ăn và được phân phối bởi máu. (Chú ý: Cơ xương chứa khoảng 97% tổng lượng carnitine trong cơ thể).

Carnitine đi vào trong các tế bào thông qua các chất vận chuyển carnitine. Trong tim, cơ và thận, chất vận chuyển ái tính cao là OCTN2 (organic cation transporter novel 2). Gan có một chất vận chuyển carnitine hiệu suất cao, ái tính thấp khác . Sự thiếu hụt carnitine nguyên phát phát triển do một khiếm khuyết trong OCTN2, gây ra sự mất carnitine trong nước tiểu và các mức thấp của cả carnitine huyết thanh và tế bào.

d. Các sự thiếu hụt carnitine: Các sự thiếu hụt carnitine gây ra sự giảm khả năng của các mô trong việc sử dụng LCFA như là một nguồn năng lượng. Sự thiếu hụt carnitine nguyên phát được gây ra bởi các khiếm khuyết trong chất vận chuyển màng mà làm ngăn cản sự hấp thu carnitine bởi cơ xương, cơ tim và thận, làm cho carnitine bị bài tiết. Việc điều trị bao gồm bổ sung carnitine. Sự thiếu hụt carnitine thứ phát xảy ra chủ yếu do các khiếm khuyết trong sự oxy hóa acid béo dẫn đến sự tích tụ của acylcarnitines mà sẽ được bài tiết trong nước tiểu, làm giảm lượng carnitine có mặt sẵn. Sự thiếu hụt carnitine thứ phát mắc phải cũng có thể được phát hiện thấy, ví dụ, ở những bệnh nhân mắc bệnh gan (sự tổng hợp carnitine giảm) hoặc những người mà sử dụng thuốc chống co giật valproic acid (giảm sự tái hấp thu của thận). (Chú ý: Các khiếm khuyết trong sự oxy hóa của ty thể cũng có thể được gây ra bởi các sự thiếu hụt trong CPT-I và CPT-II. Sự thiếu hụt CPT-I ảnh hưởng đến gan, nơi mà xảy ra sự mất khả năng sử dụng LCFA để sinh năng lượng, làm giảm mạnh khả năng của mô trong việc tổng hợp glucose [một quá trình nội sinh] trong suốt quá trình nhịn ăn. Điều này có thể dẫn đến hạ đường huyết nghiêm trọng, hôn mê và tử vong. Sự thiếu hụt CPT-II có thể ảnh hưởng đến gan, cơ xương và cơ tim. Dạng thưởng gặp nhất [và ít nghiêm trọng nhất] sẽ ảnh hưởng đến cơ xương. Nó có biểu hiện yếu cơ với tăng myoglobin máu theo sau một quá trình luyện tập thể thao kéo dài. Điều trị bao gồm tránh nhịn ăn và chấp nhận một chế độ ăn giàu carbohydrates và ít chất béo nhưng được bổ sung bởi TAG chuỗi trung bình).

2. Sự đi vào trong ty thể của acid béo chuỗi ngắn hơn: Các acid béo chứa 12 carbons hoặc ít hơn có thể đi qua màng trong ty thể mà không cần sự hỗ trợ của carnitine hay hệ thống CPT. Một khi đã ở trong ty thể thì chúng được hoạt hóa thành các dẫn xuất CoA của chúng bởi các enzyme chất nền ty thể và được oxy hóa. (Chú ý: Các acid béo chuỗi trung bình thì có nhiều trong sữa người. Bởi vì sự oxy hóa của chúng thì không phụ thuộc vào CPT-I nên malonyl CoA thì không có vai trò ức chế).

3. Các phản ứng của sự oxy hóa beta: Chu trình đầu tiên của sự oxy hóa β được thể hiện trong Hình 17. Nó bao gồm một trình tự của 4 phản ứng liên quan với β-carbon (carbon 3) mà gây ra sự làm ngắn chuỗi acid béo đi 2 carbons ở đầu carboxylate. Các bước bao gồm một sự oxy hóa mà tạo ra FADH₂, một sự hydrat hóa, một sự oxy hóa thứ hai mà tạo ra NADH và một sự phân tách thiolytic (lưu phân) phụ thuộc CoA mà giải phóng ra một phân tử acetyl CoA. Mỗi bước được xúc tác bởi các enzymes mà có tính đặc hiệu độ dài chuỗi (chain-length specificity). (Chú ý: Đối với LCFA, 3 bước cuối cùng được xúc tác bởi một protein 3 chức năng). Bốn bước này được lặp lại đối với các acid béo bão hòa có số chẵn carbon (n/2) – 1 lần (trong đó n là số carbons), mỗi chu trình sản xuất một acetyl CoA cùng với một NADH và một FADH₂. Chu kỳ cuối cùng sản xuất 2 acetyl CoA. Acetyl CoA có thể được oxy hóa hoặc được sử dụng trong quá trình tạo ketone của gan (xem phần V. trong phần 3 nhé). Các coenzymes khử được oxy hóa bởi chuỗi truyền electron, NADH bởi Complex I và FADH₂ bởi coenzyme Q. (Chú ý: Acetyl CoA là một chất tác động dị lập thể dương [positive allosteric effector] của pyruvate carboxylase [xem bài viết trước], vì thế, liên kết sự oxy hóa acid béo với quá trình tân tạo đường).

4. Sự tạo năng lượng của sự oxy hóa β: Năng lượng thu được từ sự oxy hóa β acid béo thì nhiều. Ví dụ, sự oxy hóa của một phân tử palmitoyl CoA thành CO₂ và H₂O tạo ra 8 acetyl CoA, 7 NADH và 7 FADH₂, từ đó 131 ATP có thể được tạo thành. Tuy nhiên, sự hoạt hóa của acid béo cần 2 ATP. Vì thế, năng lượng tạo thành tổng cộng từ palmitate là 129 ATP (Hình 18). Một sự so sánh các quá trình tổng hợp và thoái hóa của các acid béo bão hòa chuỗi dài có số chẵn carbon được cung cấp trong Hình 19.

**Hình 18** – Năng lượng thu được từ sự oxy hóa của palmitoyl coenzyme A (CoA) (16 carbons). (Chú ý: *Sự hoạt hóa của palmitate thành palmitoyl CoA cần 2ATP [ATP → AMP + PP_i]). FADH₂ = flavin adenine dinucleotide; NADH = nicotinamide adenine dinucleotide; TCA= tricarboxylic acid; CoQ = coenzyme Q; CO₂ = carbon dioxide.

**Hình 19** – Sự so sánh quá trình tổng hợp và thoái hóa của các acid béo bão hòa, có số chẵn carbon, chuỗi dài. NADPH = nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; NAD⁺ = nicotinamide adenine dinucleotide; FAD = flavin adenine dinucleotide; CoA = coenzyme A.

5. Sự thiếu hụt acyl CoA béo chuỗi trung bình dehydrogenase: Trong ty thể, có 4 loại acyl CoA béo dehydrogenase (fatty acyl CoA dehydrogenase), mỗi loại trong số đó là khác nhau nhưng trùng lặp tính đặc hiệu đối với các acids béo chuỗi ngắn, chuỗi trung bình, chuỗi dài hoặc chuỗi rất dài. Sự thiếu hụt của mỗi một trong số các dehydrogenases này đã được ghi nhận, tuy nhiên, sự thiếu hụt acyl CoA béo chuỗi trung bình dehydrogenase (MCAD) là vấn đề thường gặp nhất khi sinh của sự oxy hóa beta. Sự thiếu hụt MCAD, một rối loạn di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, thì được phát hiện ở 1:14,000 đứa trẻ sinh ra trên khắp thế giới, với một tỷ lệ cao hơn ở những người da trắng có gốc Bắc Âu. Nó gây ra sự giảm khả năng oxy hóa các acid béo với 6 đến 10 carbons, một sự giảm sản xuất của acetyl CoA và một sự tăng dựa vào glucose để sinh năng lượng, điều này gây ra một sự hạ đường máu do hạ ketone (hypoketotic hypoglycemia) ở các bệnh nhân. Các nghiên cứu nước tiểu trong phòng thí nghiệm cho thấy một sự tích tụ acyl carnitines chuỗi trung bình và các acid dicarboxylic chuỗi trung bình. Điều trị bao gồm việc tránh tình trạng nhịn ăn.

6. Sự oxy hóa các acid béo có số lẻ carbons: Quá trình này thực hiện bởi cùng các bước phản ứng như của các acid béo có một số chẵn carbon, cho đến khi 3 carbon cuối cùng được đạt đến. Sản phẩm này, propionyl CoA, được chuyển hóa bởi một con đường 3 bước (Hình 20). (Chú ý: Propionyl CoA cũng được sản xuất trong suốt quá trình chuyển hóa của các amino acids nhất định).

**Hình 20** – Sự chuyển hóa của propionyl CoA. ADP = adenosine diphosphate; (HCO₃^–) = bicarbonate; P_i = phosphate vô cơ.

a. Sự tổng hợp D-methylmalonyl CoA: Đầu tiên, propionyl CoA được carboxyl hóa, hình thành nên D-methylmalonyl CoA. Enzyme propionyl CoA carboxylase có một nhu cầu tuyệt đối đối với các coenzymes biotin và ATP, giống như ACC và hầu hết các carboxylases khác.

b. Sự hình thành L-methylmalonyl CoA: Tiếp theo, D-isomer được chuyển thành dạng L bởi enzyme methylmalonyl CoA racemase.

c. Sự tổng hợp succinyl CoA: Cuối cùng, các carbons của L-methylmalonyl CoA được sắp xếp lại, hình thành nên succinyl CoA, chất mà có thể đi vào trong chu trình TCA. (Chú ý: Đây chỉ là ví dụ về một tiền thân tạo đường được tạo ra từ sự oxy hóa acid béo). Enzyme methylmalonyl CoA mutase cần một dạng coenzyme của vitamin B12 (deoxyadenosylcobalamin). Phản ứng của mutase là một trong số chỉ 2 phản ứng trong cơ thể mà cần đến vitamin B12 (xem các bài viết tiếp theo). Enzyme phụ thuộc vitamin B12 khác là methionine synthase, xúc tác cho sự tổng hợp của methionine từ homocysteine. Phản ứng này là thiết yếu cho sự tái tạo folate và cho sự chuyển đổi của vitamin B12 thành dạng coenzyme của nó. Kết quả, các dấu hiệu sớm của các sự thiếu hụt folate và vitamin B12 là các bất thường huyết học tương tự nhau. Ở các giai đoạn trễ trong sự thiếu hụt vitamin B12 thì các triệu chứng thần kinh khởi phát, như dị cảm (paresthesias), tê (numbness) và thất điều (ataxia). Ở những bệnh nhân mà bị thiếu hụt vitamin B12, cả propionic và methylmalonic acid (MMA) sẽ được bài tiết trong nước tiểu. MMA huyết thanh tăng lên là một sự đo lường chẩn đoán hữu ích để phân biệt một sự thiếu hụt vitamin B12 với một sự thiếu hụt folate. Toan nước tiểu và toan máu do methylmalonic di truyền có thể xuất phát từ một sự thiếu hụt methylmalonyl CoA mutase hay methionine synthase.

7. Sự oxy hóa β của acid béo không bão hòa: Sự oxy hóa của các acid béo không bão hòa tạo ra các trung gian mà không thể đóng vai trò là các cơ chất cho 2,3-enoyl CoA hydratase (xem Hình 17). Kết quả, các enzyme bổ sung thêm là điều cần thiết. Sự oxy hóa của một liên kết đôi ở một carbon lẻ, như 18:1(9) (oleic acid), cần một enzyme bổ sung, 3,2-enoyl CoA isomerase, giúp chuyển dẫn xuất 3-cis thu được sau 3 chu kỳ oxy hóa β thành dẫn xuất 2-trans mà được cần bởi hydratase. Sự oxy hóa của một liên kết đôi tại một carbon chẵn, như 18:2(9,12) (linoleic acid), cần một 2,4-dienoyl CoA reductase phụ thuộc NADPH (NADPH-dependent 2,4-dienoyl CoA reductase) ngoài isomerase. (Chú ý: Bởi vì các acid béo không bão hòa thì ít bị khử hơn các acid béo bão hòa nên ít các đương lượng khử được sản xuất bởi sự oxy hóa của chúng).

8. Sự oxy hóa beta của peroxisome: VLCFA có 22 carbons hoặc nhiều hơn sẽ trải qua một sự oxy hóa beta ban đầu trong các peroxisomes, bởi vì các peroxisomes chứ không phải ty thể là vị trí chủ yếu của synthetase mà giúp hoạt hóa các acid béo có chiều dài này. Acid béo bị làm ngắn đi (liên kết với carnitine) khuếch tán đến một ty thể để oxy hóa thêm. Ngược lại với sự oxy hóa β của ty thể, sự dehydrogen hóa ban đầu trong các peroxisomes được xúc tác bởi một acyl CoA oxidase chứa FAD (FAD-containing acyl CoA oxidase). FADH₂ sản xuất ra bị oxy hóa bởi O₂, O₂ bị khử thành hydrogen peroxide (H₂O₂). Vì thế, không có ATP được tạo ra từ bước này. H₂O₂ được khử thành H₂O bởi catalase (xem bài viết trước). (Chú ý: Các khiếm khuyết di truyền trong cả khả năng hướng các proteins chất nền đến các peroxisomes [gây ra hội chứng Zellweger, một rối loạn phát sinh sinh học của peroxisome] hoặc vận chuyển VLCFA qua màng peroxisome [gây ra loạn dưỡng chất trắng thượng thận liên kết NST X – X-linked adrenoleukodystrophy] dẫn đến sự tích tụ của VLCFA trong máu và các mô).

C. Sự oxy hóa α của peroxisome

Phytanic acid phân nhánh, một sản phẩm của sự chuyển hóa chlorophyll, thì không phải là một cơ chất cho acyl CoA dehydrogenase do nhóm methyl trên beta-carbon của nó (Hình 21). Thay vào đó, nó được hydroxyl hóa ở α-carbon bởi phytanoyl CoA α-hydroxylase (PhyH); carbon 1 được giải phóng dưới dạng CO₂; và sản phẩm, pristanal dài 15 carbons, bị oxy hóa thành pristanic acid, chất mà được hoạt hóa thành dẫn xuất CoA của nó và trải qua sự oxy hóa β. Bệnh Refsum là một rối loạn hiếm di truyền lặn trên NST thường được gây ra bởi một sự thiếu hụt PhyH của peroxisome. Tình trạng này gây ra sự tích tụ của phytanic acid trong huyết tương và các mô. Các triệu chứng chủ yếu là các triệu chứng thần kinh và điều trị liên quan đến sự hạn chế trong chế độ ăn để ngừng tiến triển của bệnh. (Chú ý: Sự oxy hóa ω [ở đầu tận methyl] cũng được biết đến và tạo thành các acid dicarboxylic. Bình thường là một con đường nhỏ của SER, sự tăng cường điều hòa của nó được thấy trong các tình trạng như là sự thiếu hụt MCAD mà giới hạn sự oxy hóa β acid béo).